Rabu, 05 Mei 2010

PEMBIAKAN MASSAL BAKTERI ENTOMOPATOGEN

PEMBIAKAN MASSAL BAKTERI ENTOMOPATOGEN

1. Media biakan bakteri
Syarat mutlak yang harus dilakukan dan diperlukan untuk mempelajari mikroorganisme adalah menumbuhkan mikroorganisme tersebut pada media buatan di laboratorium. Untuk it, kita perlu mengetahui bahan-bahan/zat-zat yang diperlukan dan kondisi fisik yang diinginkan oleh setiap mikroorganisme. Khusus untuk bakteri entomopatogen, media biakan bakteri tidak boleh menurunkan virulensinya untuk menyerang patogen.
Berdasarkan hasil penelitian, para ahli dapat menentukan bahan-bahan yang baik dan cocok untuk pertumbuhan mikroorganisme dengan pertumbuhan maksimal. Tempat tumbuh ini selanjutnya disebut medium (media). Setiap mikroorganisme mempunyai kebutuhan nutrisi yang berbeda-beda, meskipun demikian kebanyakan bakteri tumbuh baik pada media dasar, yaitu media yang terdiri dari: ekstrak daging (beef extract), NaCl, dan aquadest. Untuk memadatkan media dapat ditambahkan agar, misalnya untuk media padat ditambahkan 3% agar, sedangkan media setengah padat ditambahkan 1,5% agar.
Ada beberapa bakteri yang tidak dapat tumbuh baik pada media dasar, untuk mendapatkan pertumbuhan yang baik dari bakteri perlu ditambahkan beberapa zat yang diperlukan ke dalam media yang digunakan, misalnya: darah, serum, ekstrak toge, kentang, dan lain-lain. Media yang demikian disebut media diperkaya (enrichment media).
Berdasarkan kepadatannya, media terbagi atas:
a. Media cair, yaitu media yang mempunyai komposisi bahan dan nutrisi yang diperlukan tanpa bahan pemadat (agar)
b. Media setengah padat (semi solid), media diberi bahan pemadat 1,5 %
c. Media padat (Media solid), ditambah 3% agar
Berdasarkan fungsinya, dikenal 3 media yaitu:
a. Media agar plate, yaitu media agar padat dalam petridish, digunakan untuk isolasi bakteri dan inumerasi (penghitungan) jumlah/populasi bakteri
b. Media agar tegak, yaitu media agar setengah padat dalam tabung reaksi, digunakan untuk menguji gerak bakteri secara makroskopis
c. Media agar miring, yaitu media agar padat dalam tabung reaksi yang diletakkan miring sehingga mempunyai permukaan media yang lebih luas daripada permukaan agar tegak, digunakan untuk menumbuhkan dan menyimpan biakan murni sebagai stock biakan murni (stock pure culture)
Tahap-tahap penyediaan media:
• Pencampuran media
• Pengaturan pH media sampai batas optimum, kebanyakan bakteri mempunyai pH optimum 7,5
• Untuk media cair, larutan dapat langsung disaring, sedangkan untuk membuat media padat atau setengah padat harus ditambah agar sesuai takaran yang diperlukan.
• Masukkan media ke dalam tempat yang sesuai dengan keperluan misalnya tabung reaksi atau erlenmeyer yang kemudian ditutup dengan kapas penyumbat
• Sterilisasi
Sterilisasi adalah cara untuk membebaskan alat-alat atau media dari mikroorganisme. Prinsip sterilisasi adalah membunuh atau menghambat pertumbuhan mikroorganisme dengan cara mengubah lingkungan, baik secara fisik maupun secara kimia. Sterilisasi secara fisik dapat dilakukan antara lain dengan cara:
a. Sterilisasi dengan temperatur tinggi
• Sterilisasi kering (dry heat): biasa digunakan untuk mensterilkan alat-alat dari gelas dengan menggunakan udara kering panas dalam oven.
• Sterilisasi basah (moist heat): dengan autoclave atau dengan system Arnold (Tyndalisasi)
b. Sterilisasi dengan temperatur rendah
c. Filter
d. Radiasi
e. Centrifuge
f. Tekanan Osmotik

2. Isolasi dan perbanyakan bakteri
Isolat Bakteri dapat diisolasi dari tanah, bagian tumbuhan, kotoran hewan, serangga dan bangkainya dan sumber lain. Salah satu cara isolasi yang cukup efektif adalah dengan seleksi asetat. Beberapa gram sumber isolat disuspensikan ke dalam media pertumbuhan bakteri (misal LB) yang mengandung natrium asetat kemudian dikocok. Media asetat tersebut menghambat pertumbuhan spora Bakteri menjadi sel vegetatif. Setelah beberapa jam media tersebut di-panaskan pada suhu 80°C selama beberapa menit. Pemanasan ini akan membunuh sel-sel bakteri atau mikroorganisme yang sedang tumbuh termasuk spora-spora bakteri lain yang tumbuh. Kemudian sebagian kecil dari suspensi yang telah dipanaskan diratakan pada media padat. Koloni-koloni yang tumbuh kemudian dipindahkan ke media sporulasi Bakteri. Koloni yang tumbuh pada media ini dicek keberadaan spora atau protein kristalnya untuk menentukan apakah koloni tersebut termasuk isolat Bakteri. Berikut adalah cara-cara pembuatan biakan murni bakteri:
a. pada media padat

1. Metode cawan gores (streak plate)
Prinsip metode ini, yaitu mendapatkan koloni yang benar- benar terpisah dari koloni yang lain, sehingga mempermudah proses isolasi. Cara ini di lakukan dengan membagi cawan ncub menjadi 3- 4bagian. Ose steril yang telah di siapkan, di letakan pada cawan berisi media steril. Goresan dapat dilakukan 3- 4kali membentuk garis horizontal disatu sisi cawn. Ose disterilkan lagi dengan api Bunsen, setelah kering ose tersebut digunakan untuk menggores goresan sebelumnya pada sisi cawn ke dua.
Langkah ini di lanjutkan hingga keempat sisi cawan tergores,. Pada metode ini, goresan di sisi pertama di harapkan kolom tumbuh padat dan berhimpit, sedangkan opada goresan sisi kedua, kolom mulai tampak jarang dan begitu pula selanjutnya, sehingga didapatkan koloni yang tampak tumbuh terpisah denag koloni lain.Seluruh tahap hendaknya dilakukan secara aseptic agar tidak terjadi kontaminasi.
2. Metode cawan tuang (pour plate)
Metode ini dilakukan dengan mengencerkan sumber isolate yang telah diketahui beratnya kedalam 9ml garam fisiologi (NaCl 0,85%) atau larutan buffer fosfat. Larutan ini berperan sebagai penyangga Ph agar sel bakteri tidak rusak akibat menurunnya Ph lingkungan. Pengeceran dapat dilakukan beberapa kali agar biakan yang didapatkan tidak perlu padat atau memenuhi cawan ( biakan terlalu padat akan mengganggu pengamatan ). Sekitar1ml suspensi dituangkan kedalam cawan Petri steril, dilanjutkan dengan menuangkan medi penyubur ( nutrient agar) steril hangat (40- 500c) kemudian ditutup rapat dan di ketakan dalam incubator (370c) selama 1- 2 hari.
3. Metode cawan sebar (spread plate)
Pada metode cawan sebar 0,1ml supsensi bakteri yang telah diencerkan di sebar pada media penyubur steril yang telah di siapkan . Selanjutnya supsensi dalam cawan diratakan dengan batang dari galski agar koloni tumbuh merata pada media dalam cawan tersebut, kemudian diletakkan dalam ncubator (370C) selama 1-2 hari. Dengan metode ini, satu sel bakteri akan tumbuh dan berkembang menjadi satu koloni bakteri. Satu koloni bakteri yang terpisah dengan koloni lainnya dapat diamati tipe pertumbuhan pada masing-masing media, diantaranya dilakukan terhadap konsistensi, bentuk koloni, warna koloni dan permukaan koloni.
Koloni yang tumbuh terpisah ditumbuhkan kembali untuk mendapatkan isolat murni. Isolat murni dilakukan dengan mengoleskan ose steril pada koloni dalam kultur campuran yang benar-benar terpisah satu sama lain. Olesan tersebut digores pada media padat agar miring dalam tabung reaksi. Koloni yang tumbuh dalam media ini merupakan isolat murni, yang hanya berasal dari satu jenis bakteri saja. Koloni yang tumbuh dapat dikarakterisasi berdasarkan tipe tumbuhnya pada media agar miring.

b. media cair
Dengan cara menyampurkan satu ose bakteri secara aseptik ke dalam media cair yang ada di tabung reaksi di depan api. Kemudian tabung ditutup rapat dengan kapas.
3. Media perbanyakan massal bakteri alternatif
Menurut Misfit Putrina dan Fardedi dalam penelitiannya menyebutkan bahwa air rendaman kedelai yang merupakan limbah tahu dan air kelapa dapat dijadikan sebagai media perbanyakan bakteri Bacillus thuringiensis yang merupakan bakteri entomopatogen Spodoptera litura karena media tersebut dinilai lebih murah dan mudah untuk didapatkan daripada Nutrien Broth yang mahal meskipun dalam perkembangannya Bt lebih cepat tumbuh di Nutrien Broth. Menurut Thiery dan Fachron (1997) kualitas nutrien pada media sangat mempengaruhi terhadap pertumbuhan, tingkat sporulasi dan produksi senyawa toksin dari Bacillus thuringiensis.
Perbanyakan bakteri skala industri biasanya menggunakan teknik fermentasi dengan suatu alat yang disebut fermentor yang kemudian menghasilkan bakteri yang siap dikemas dan dipasarkan.
Selanjutnya Sjamsuripura et al. (1984), menyatakan bahwa Bt membutuhkan air, karbon, energi, nitrogen, elemen mineral dan faktor pertumbhan (suhu, pH, aerasi). Karbon adalah sumber utama dalam sintesa untuk menghasilkan sel baru dan karbohidrat merupakan sumber karbon yang mungkin dan paling ekonomis. Nitrogen yang dibutuhkan biasanya diperoleh dari garam-garam amonium, tetapi Bt membutuhkan pula Nitrogen organik yang harus diberikan dalam bentuk asam amino tunggal atau mterial kompleks meliputi asam nukleat dan vitamin. Kebutuhan asam amino sangat bervariasi antara satu galur dengan galur lainnya, oleh karena itu bila pola kebutuhan asam amino suatu galur belum diketahui secara pasti sebaiknya sumber nitrogen diberikan dalam bentuk dimana semua jenis asam amino terdapat di dalamnya. Bentuk yang murah dari nitrogen organik adalah material kaya protein dari binatang dan tumbuhan, seperti tepung kedelai, sari rendaman jagung, ekstrak ragi dan sebagainya. Untuk menjamin sporulasi yang sempurna Bt membutuhkan perimbangan yang serasi antara sumber karbon dan nitrogen.

1 komentar:

  1. wah infonya cukup bermanfaat, soalnya saya sedang belajar tentang bakteri karena tanaman saya banyak yang mati terserang bakteri. maaf ba, tau cara memperbanyak bakteri em4 ga, kalau tau posting ya ba!

    BalasHapus